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土壤氨基糖实验方法介绍

日期： 2024-07-15

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土壤氨基糖实验流程如下：

一、实验方法及原理

氨基糖在吡啶-甲醇溶液中,以 4-二甲氨基吡啶为催化剂的条件下与盐酸羟胺和乙酸酐发生糖腈乙酰酯反应, 所得衍生物可利用气相色谱测定。

二、实验步骤

2.1主要实验仪器

GC（毛细管分流进样口， FID检测器）

鼓风烘箱（涵盖105℃，可定时8h）

涡旋混合仪（2850rpm）

离心机（50mL，3650rpm）

冷冻干燥机

水浴锅（45℃、80℃）

旋转蒸发仪（100mL，65℃）

离心机（5mL，8000rpm）

2.2 实验步骤

1、水解：称取约0.5~1.0g的土样于水解管中，沿管壁加入5 mL 6 mol/L盐酸，用氮气置换水解管中空气2min后密封。在烘箱中105℃放置8h水解。

2、净化：

a) 除酸：待水解液冷却至室温后，加入200μgN-甲基氨基葡萄糖（1mg/mL水溶液，200μL）。涡旋仪震荡30s混匀。取部分水解液于5mL离心管中，于8000rpm离心1min。取上清液2.5mL于50mL离心管中用氮气于65℃吹干。用25mL纯水溶解吹干后的残渣。加0.4mol/LKOH和0.01mol/LHCL调节pH至6.6~6.8。

b) 除盐：离心管以3000rpm离心5min，转移出上清液于100mL茄型瓶中，于65℃，25rpm旋转蒸发至干。再加入10mL无水甲醇分两次溶解瓶中残渣。后转移至另一50mL离心管。氮吹至5mL以下，涡旋溶解管壁有机物后，以4000rpm离心5min，除盐。再将上清液转移到5mL衍生瓶中并加入100μg戊五醇（1mg/mL水溶液，100μL），于40℃氮气吹干。

3、标准样品制备：

同时准备3个标准样品。另取衍生瓶中加入100μL混标（1mg/mL的氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖，0.5mg/mL胞壁酸），100μgN-甲基氨基葡萄糖（1mg/mL水溶液，100μL），100μg戊五醇（1mg/mL水溶液，100μL），轻轻摇匀后，与样品衍生瓶一起吹干。

4、衍生：

a) 向吹干的样品和标准样品的衍生瓶中加入300μL衍生试剂（称取盐酸羟胺320mg，4-二甲基氨基吡啶400mg，用吡啶：甲醇=4:1（v:v）溶液溶解稀释至10ml）后盖紧。涡旋30s混匀。

b) 在80℃水浴35min，每5min震荡一次。冷却至室温后加入1mL醋酐，涡旋30s混匀后，在80℃水浴25min，每5min震荡一次。衍生管冷却至室温后加入1.5mL二氯甲烷，涡旋30s混匀。

5、衍生物净化：

a) 往衍生管中加入1mL1mol/LHCL（取6 mol/L盐酸约17mL，加水定容至100mL，摇匀）加盖密封后涡旋30s。静置分层后吸出上层无机相。

b) 改加1mL纯水，重复上述步骤3次。最后一次尽量吸出无机相。

c) 剩余有机相于44℃下氮吹干。然后溶解到300μL稀释剂（乙酸乙酯：正己烷=1:1（V:V）），然后转移到带内插管进样瓶中待测。

2.3色谱条件

土壤氨基糖实验方法介绍

2.4测定方法

依据保留时间一致性进行定性识别，单浓度内标法定量。根据标准样品的保留进间确定样品中目标物的色谱峰。以标准样品中N-甲基氨基葡萄糖与目标物的峰面积、实际量比值得出目标物质与内标物之间的校正参数。再根据样品中内标物峰面积与目标物峰面积计算得出样品中目标物的量，从而计算样品中目标物的含量。

因为对照品跟样品中加入了等量的戊五醇，因此根据对标准样品和样品中戊五醇的峰面积响应值之比计算样品中戊五醇的回收率来判断样品前处理过程的损失是否合理。

2.5计算方法

内标校正参数计算：

式中：

f——校正参数

A标——标准样品中目标标准物质峰面积；

m标——标准样品中目标标准物质的量，μg；

A_{N-甲基氨基葡萄糖}——标准样品中N-甲基氨基葡萄糖标准物质峰面积；

m_{N-甲基氨基葡萄糖}——标准样品中N-甲基氨基葡萄糖标准物质的量，μg。

样品含量计算：

式中：

w——样品中目标物质的含量，μg/g

f——校正参数

A样——样品中目标标准物质峰面积

m样——样品称样量，g

A_{N-甲基氨基葡萄糖}——标准样品中N-甲基氨基葡萄糖标准物质峰面积

m_{N-甲基氨基葡萄糖}——标准样品中N-甲基氨基葡萄糖标准物质的量，μg

以戊五醇为目标物计算回收率：

式中：

R——戊五醇回收率，%；

A样——样品中戊五醇峰面积

A|样——标准样品中戊五醇峰面积的平均值

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