土壤微生物碳的测定--仪器分析法

1、仪器与试剂：

自动有机碳分析仪、真空干燥器、小烧杯（蒸发皿）、塑料瓶、中速定量滤纸、漏斗、震荡仪、电子称等

（1）无乙醇氯仿：氯仿中含有少量乙醇做稳定剂，乙醇会影响氯仿在低压下沸腾。所以需要提纯。

提纯：在通风橱中，将氯仿（三氯甲烷）按1:2的体积比与蒸馏水一起加入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出下层氯仿于烧杯中，如此重复洗涤三次。得到无乙醇氯仿，加入适量无水氯化钙，去除氯仿中的水分。可重复使用。

（2） 0.5mol/L硫酸钾溶液：称取硫酸钾87.1g，溶于去离子水中，稀释至1000ml

（3）  1mol/L NaoH溶液：称取氢氧化钠（AR）4g，置于一大烧杯中，并立即倒出，然后加入不含二氧化碳的蒸馏水约100mL，将溶液注入细口瓶中，塞紧橡皮塞，混匀，备用。 

2、操作步骤：

（1）培养

①称取过2mm筛的新鲜土样（相当于干土10g，取部分样测含水量，确定称取土样重量）2份，分别放入25ml小烧杯（培养皿）中。将盛有一份土样的烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约放置烧杯2/3的量）的25ml烧杯，烧杯内放入少量防爆沸玻璃珠，同时放入盛有1mol/L NaOH溶液的小烧杯（吸收熏蒸过程中释放出来的CO2）。

②盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿保持沸腾5min。关闭真空干燥阀门，于25度黑暗条件下培养24h。另一份样置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

③熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应该听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做，取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5到6次，每次30分钟，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

④从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样转移到80ml聚乙烯离心管（塑料瓶）中，加入40ml 0.5mol/L 硫酸钾溶液（土水比1：4）800 r/min振荡30分钟，用中速定量滤纸过滤。同时做一个无土壤机制空白。土壤提取液最好立刻分析，或--20℃冷冻保存，使用前需解冻摇匀。

仪器测定法：

吸取上述土壤提取液10ul注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。（仪器使用方法待定）

3、结果计算： 

土壤微生物生物量碳：Bc=Ec/Kec

Ec为熏蒸与未熏蒸土壤的差值；

Kec为转换系数，取值为0.45

土壤微生物氮--氯仿熏蒸-TOC

1. 微生物氮测定

1.1、实验试剂

所有试剂除注明者外，均为分析纯。实验用水为蒸馏水或去离子水或相当浓度的水。

（1）无乙醇氯仿：氯仿中含有少量乙醇做稳定剂，乙醇会影响氯仿在低压下沸腾。所以需要提纯。

提纯：在通风橱中，将氯仿（三氯甲烷）按1:2的体积比与蒸馏水一起加入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出下层氯仿于烧杯中，如此重复洗涤三次。得到无乙醇氯仿，加入适量无水氯化钙，去除氯仿中的水分。可重复使用。

（2）硫酸钾提取剂；

（3）硫酸铬钾还原剂；

（4）硫酸铜溶液；

（5）10 mol L-1氢氧化钠溶液；

（6）4 mol L-1氢氧化钠溶液；

（7）0.01 mol L-1氢氧化钠溶液；

（8）硼酸溶液；

（9）标准硼砂溶液；

（10）指示剂贮存液；

（11）指示剂溶液；

（12）标准氯化铵贮存液；

（13）标准氯化铵溶液。

1.2、实验仪器

流动注射氮分析仪、真空抽滤瓶、容量瓶、其他仪器设备同土壤微生物碳。

1.3、实验步骤

（1）土壤前处理、熏蒸、提取同微生物碳处理。

（2）提取液中硝态氮还原：吸取15.0 ml熏蒸与不熏蒸土壤0.5 mol L-1 K2SO4浸提液于250 ml消化管中，加入10 ml硫酸铬钾还原剂和300 mg锌粉，至少放置2 h后再消化。研究结果表明熏蒸与不熏蒸土壤提取液中硝态氮含量差异很小，在测定土壤MB-N时，可以不包括硝态氮，即省略提取液中硝态氮还原过程。

（3）消化：方法Ⅰ：吸取10.0 ml熏蒸与不熏蒸土壤0.5 mol L-1  K2SO4浸提液（或经还原反应后的浸提液）于250 ml消化管中，加入0.2 ml 0.19 mol L-1 CuSO4溶液、5 ml分析纯浓硫酸、及少量防瀑沸的颗粒物（如经浓硫酸处理并洗涤后烘干的瓷片，0.5 cm大小），混合液消化变清后再回流3 h。

（4）消化液中氮测定：消化液冷却后，用去离子水洗涤转移到100 ml容量瓶中，至体积大约为70 ml，待再冷却后慢慢加入10 ml 10 mol L-1NaOH溶液中和部分H2SO4，边加边充分混匀（以免因局部碱浓度过高而引起消化液中NH4+的损失），再用去离子水定容至100 ml。溶液中NH4+含量采用流动注射氮分析仪（FIAStar 5000型）测定。采用40 µl样品圈，KTN扩散膜（耐强酸和强碱），载液为去离子水，试剂Ⅰ为4 mol L-1 NaOH溶液，试剂Ⅱ为指示剂溶液。

（5）校正曲线溶液制备：分别取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml 50 µg N ml-1标准氯化铵溶液于100 ml容量瓶中，分别用去离子水洗涤转移1个空白消化液于容量瓶中，其余操作步骤同样品，用去离子水定容至100 ml，即得浓度分别为0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 µg N ml-1系列标准氯化铵溶液，采用测定KTN方法模块测定和制备工作曲线，校正曲线溶液最少应每个月制备一次。其他具体操作参见仪器使用说明。

1.4、计算：

土壤MB-N = EN/KEN

式中：EN = 熏蒸土壤提取的全氮 – 不熏蒸土壤提取的全氮；

kEN为转换系数，取值0.25。

土壤微生物磷的测定--无机磷测定法

1、仪器与试剂：分光光度计，培养皿、真空干燥器、25ml、1000ml容量瓶、塑料瓶。

（1）无乙醇氯仿

（2）0.5mol/L NaHCO3 浸提液：溶解 NaHCO3 42.0g于800mL水中，以0.5mol/L NaOH溶液调节浸提液的PH至8.5，再用去离子水稀释至1000mL。（此溶液爆于空气中可因失去CO2而使PH增高，应现配现用）

（3）250mg/L磷酸二氢钾溶液：称取1.0984g分析纯磷酸二氢钾（称量前105℃烘2-3小时），溶于去离子水并定容至1000mL .

（4）钼锑抗试剂：

5g /L酒石酸氧锑钾溶液：称取钼酸铵0.5g，溶于100mL水中

‚钼酸铵-硫酸溶液：称取钼酸铵10g，溶于450mL水中，缓慢地加入153mL浓H2SO4，边加边搅拌。

再将上述溶液加入到‚溶液中，最后加水至1000mL 。充分摇匀，储存于棕色瓶中，此为钼锑抗混合液。

临用前（当天），称取左旋抗坏血酸1.5g，溶于100mL 钼锑抗混合液中，混匀，此即钼锑抗试剂。有效期24h。

（5）磷标准溶液：准确称取在105℃烘箱中的KH2PO4（分析纯）0.2195g，溶解在400mL水中，加浓H2SO4 5mL（加H2SO4防长霉菌，可使溶液长期保存），转入1000mL容量瓶中，加水至刻度。此溶液为50ug/mL磷标准溶液。吸取上述磷标准溶液25mL，用去离子稀释定容至250mL，即得5ug/mL磷标准溶液（此溶液不宜久存）。

（6）0.5mol/L NaOH溶液：称取氢氧化钠（AR）2g，置于一大烧杯中，并立即倒出，然后加入不含二氧化碳的蒸馏水约100mL，将溶液注入细口瓶中，塞紧橡皮塞，混匀，备用。

2、操作步骤：

（1）称取过称取过2mm筛的新鲜土样（相当于干土5g）3份，分别放入3个25ml小烧杯中。一份熏蒸，两份不熏蒸。熏蒸处理同测定微生物碳。

（2）从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸一份土样，将土样转移到250毫升聚乙烯提取瓶（塑料瓶）中，加入100ml 0.5mol/L NaHCO3 浸提液（水土比20:1）,300r/min振荡30min ,用慢速定量滤纸过滤。同时做一个无土壤机制空白。土壤提取液最好立刻分析，或-20℃冷冻保存，使用前需解冻摇匀。

（3）另一份未熏蒸土样放入250毫升聚乙烯提取瓶（塑料瓶），加入0.5ml 250mg/L磷酸二氢钾溶液，再加入100mL 0.5mol/L NaHCO3 浸提液，同上进行提取。（用来测定外加正磷酸盐态无机磷的回收率Rpi，以校正土壤对熏蒸处理所释放出来的微生物生物量磷的吸附与固定。）

（4）吸取上述3种提取液10ml（依样品含磷量而定）于25ml容量瓶中，吸取外加磷的提取液5ml。加入适量的1.0mol/L HCL溶液进行中和，HCL溶液的加入量通常为提取液体积的一半。（即加入5ml,外加磷的提取液加入2.5ml）,放置4小时并间隙振荡（以排除溶液中的CO２）补充去离子水至20mL（看情况添加），加入4mL混合显色剂，再加水定容，摇匀。显色完全（约30min）后，在880nm波长处进行比色。

3、标准曲线：准确吸取5ug/mL，磷标准溶液0、0.5、1、2、3、4、5mL分别放入25ml容量瓶中，加水约至20ml，然后加钼锑抗试剂4ml,最后用水定容至25mL。30min后开始进行比色。

4、结果计算：土壤微生物生物量磷（Bp）：Bp=Epi/(Kp*Rpi)

式中：

Epi为熏蒸和未熏蒸土壤的差值；

Rpi为（外加磷酸二氢钾溶液土壤的测定值-未熏蒸土壤的测定值）/25*100%；

Kp为转换系数，取值为0.4。