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植物激素的测定(高效液相色谱法)

日期: 2021-12-02
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植物激素是植物细胞接受特定环境信号诱导产生的、低浓度时可调节植物生理反应的活性物质。在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发以及离体组织培养等方面,分别或相互协调地调控植物的生长发育与分化。今天便给大家整理了如何通过高效液相色谱法测定植物激素的流程,具体如下:

植物激素的测定(高效液相色谱法)

一、实验原理

本实验以异丙醇/水/盐酸提取方法提取样品中植物内源激素,以安捷伦1290高效液相色谱仪串联AB公司Qtrap6500质谱仪测定植物内源激素IAA、ABA、IBA、GA1/3/4/7、Z、TZR、IP、IPA、SA、MESA、MEJA、JA。本实验采用异丙醇/水/盐酸溶液的方法,通过提取液加酸提高激素在有机溶剂中溶解性并钝化组织中的部分酶。而后通过二氯甲烷萃取并以氮气吹扫方式浓缩样品,该方法流程相对简单,待测物损失较小,同时由于Qtrap6500仪器的灵敏性,不需过多繁琐的净化步骤即可准确检测大部分痕量待测物。

二、试剂

2.1异丙醇/盐酸提取缓冲液

2.2二氯甲烷

2.3 甲醇

2.4 0.1%甲酸

三、主要仪器

台式高速离心机(德国SORVAL公司)

AR5120电子天平(美国AHOΜS公司)

Aglient1290高效液相色谱仪(美国aglient公司)

SCIEX-6500Qtrap(MSMS)(美国AB公司)

UYC-200全温培养摇床(上海新苗医疗器械制造公司)

氮吹仪(杭州米欧仪器有限公司)

四、试样的制备

取新鲜样本剪碎充分混匀后,装入样本瓶放入4℃冷藏备用。

五、分析步骤

5.1激素提取

(1)准确称量约1 g新鲜植物样品,于液氮中研磨至粉碎;

(2)向粉末中加入10 ml异丙醇/盐酸提取缓冲液,4℃振荡30 min;

(3)加入20 ml二氯甲烷,4℃震荡30 min;

(4)4℃,13000 r/min离心5 min,取下层有机相;

(5)避光,以氮气吹干有机相,以400 µl甲醇(0.1%甲酸)溶解;

(6)过0.22 µm滤膜,进HPLC-MS/MS检测。

5.2 液质检测

(1)标准溶液配制

以甲醇(0.1%甲酸)为溶剂配制梯度为0.1 ng/ml,0.2 ng/ml,0.5 ng/ml, 2 ng/ml,5 ng/ml, 20 ng/ml,50 ng/ml,200 ng/ml的IAA、IBA、ABA、GA1/3/4/7、Z、 TZR、IP、IPA、JA、MEJA、SA、MESA标准溶液。每个浓度做2个重复,在实际绘制标曲方程时去掉线性不好的点。

(2)液相条件

色谱柱:poroshell 120 SB-C18反相色谱柱(2.1×150,2.7 μm);

柱温:30℃;

流动相:A:B=(甲醇/0.1%甲酸):(水/0.1%甲酸);

洗脱梯度:0-1 min,A=20%;1-9 min,A递增至80%;9-10 min,A=80%;10-10.1 min,A递减至20%;10.1-15 min, A=20%

进样体积:2 µl。

(3)质谱条件

气帘气:15 psi

喷雾电压: 4500 v

雾化气压力:65 psi

辅助气压力:70 psi

雾化温度: 400℃

表1 植物激素质子化或去质子化的选择反应监测条件([M+H]+or[M-H]-)

植物激素的测定(高效液相色谱法)

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