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如何检测土壤蔗糖酶?——靛酚蓝比色法

日期: 2021-09-18
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土壤蔗糖酶是作用物β-D-呋喃果糖苷中未还原的β-D-呋喃果糖苷末端残基的水解酶,能酶促土中蔗糖水解成葡萄糖和果糖。今天,我们就来聊聊如何通过靛酚蓝比色法检测土壤蔗糖酶。

如何检测土壤蔗糖酶?——用靛酚蓝比色法

.试剂

1)3,5-二硝基水杨酸溶液:称0.5g二硝基水杨酸,溶于20ml 2N氢氧化钠和50ml水中,再加18.2g酒石酸钾钠,用水稀释至100ml(不超过7天)。 

2pH5.5磷酸缓冲液:1/15M磷酸氢二钠(11.867g Na2PO4•2H2O溶于1L蒸馏水中)0.5ml加1/15M 磷酸二氢钾(9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中)9.5ml即成。 

3)8%蔗糖溶液。 

4)甲苯。 

5)标准葡萄糖溶液:将葡萄糖先在50-58℃条件下,真空干燥至恒重。然后取500mg溶于100ml 12mmol苯甲酸溶液中(5mg还原糖/ml),即成标准葡萄糖溶液。 

二.主要仪器

万分之一分析天平,恒温箱,水浴锅,分光光度计

三.试样的制备

取新鲜的实验室待测样品充分混匀后,按四分法缩减至 100g,粉碎,然后全部通过 10目孔径筛,装入样品袋备用。 

四.分析步骤 

4.1 试样溶液提取

称取试样2g,精准至0.001g,置于50ml三角瓶中,注入15ml 8%蔗糖溶液,5ml pH5.5磷酸缓冲液和0.25ml甲苯。摇匀混合物后,放入恒温箱,在37℃下培养24h。到时取出,迅速过滤滤液供蔗糖酶的测定。

4.2 空白溶液制备

除不加待测样品外,应用的试剂和步骤操作同4.1

4.3 对照试样溶液制备

除用蒸馏水代替蔗糖溶液外,应用的试剂和步骤操作同4.1

4.4 标准曲线绘制

0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml含5mg还原糖/ml的标准葡萄糖溶液到50ml容量瓶中,加3ml 3,5-二硝基水杨酸,并在沸水的水浴锅中加热5min,随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色,最后用蒸馏水稀释至50ml,并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。   

4.5 试样测定

样品滤液中吸取1ml,若浓度过低,可多取滤液。注入50ml容量量瓶中,加3ml 3,5-二硝基水杨酸,同测定标准曲线同样的方法进行显色比色。     

五.结果计算 

蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。 

葡萄糖(毫克)=a×50×ts/m 

a-显色液中葡萄糖浓度(mg/ml), 

50-显色液体积(ml); 

ts-分取倍数(吸1ml滤液比色就是20/1); 

m-烘干土质量(g)。

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