1. 产品概要
重组克隆技术是目前一种最新型、快速、简洁的克隆技术，PCR产物连接载体不受酶切位点限制。将载体在选择克隆位点处进行线性化后，在插入片段 PCR 引物 5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段 PCR 产物 5’和 3’ 最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15 bp～20 bp)。这种两端带有载体末端序列的 PCR 产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在Clone Mix 的催化作用下，仅需反应 50min 即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达 95%以上。
产品优点 :
—简单、快速、高效
—稳定性强，室温可长期储存
—适用于几乎任何载体多克隆处任何位点进行定向克隆
—无需考虑插入片段自身携带的酶切位点
—可高效克隆 50 bp～10 kb 片段
—不依赖于连接酶及磷酸酶，克隆阳性率可达 95%以上
应用范围：
—适用于大片段
—快速克隆
—高通量克隆
—无缝克隆
—DNA 定点突变
2. 产品组成
组分 | 50T | 100T |
Clone Mix | 200ul | 400ul |
3. 实验方案
3.1 实验流程
1）线性化载体制备
2）设计插入片段扩增引物
3）插入片段 PCR 扩增
4）重组反应
5）转化、涂板
6）阳性克隆鉴定
3.2 线性化载体制备
选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。克隆载体线性化方式可以为限制性内切酶酶切消化，也可以为反向 PCR 扩增。
3.3 插入片段扩增引物设计
引物设计是很重要的，在设计引物时同样要遵循引物设计的基本原则，只不过上下游引物要加上 15~20bp 的载体同源序列。引物序列包括：5’-15~20bp 同源序列所需酶切位点序列（此处可不加）-特异性引物序列-3’。
3.4 插入片段 PCR 扩增
插入片段可用任意 PCR 酶(Taq 酶或高保真酶)扩增，无需考虑产物末端有无 A加尾(重组过程中将被去除，在最终载体中不会出现)。我们推荐您使用高保真聚合酶进行扩增，以减少扩增突变的引入。PCR 结束后，取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性。
Clone Mix 重组反应体系兼容常规 PCR 反应体系。因此，如扩增模板不是与克隆载体抗性相同的环状质粒，且 PCR 产物电泳条带单一，扩增产物无需纯化便可直接用于重组反应。若 PCR 扩增产物 DNA 纯度较低，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都将会有所降低。因此，在进行较大片段(>5kb)克隆实验时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对
扩增产物进行胶回收纯化以提高 DNA 纯度。
3.5 进行重组反应
于室温配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉
入管底。
组分 |
|
Clone mix | 4ul |
插入片段 | 1-2ul |
线性化载体 | 2ul |
ddH2O | 补足至10ul |
无需冰上操作。混合后，55℃水浴 20min，再 30℃水浴 30min，转化或置于-20℃冰箱保存
3.6 反应产物转化、涂板
取 5 μl 反应液，加入到 50 μl 感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30 min。42℃热激 90 s，冰水浴孵育 2 min。加入 900 μl SOC 或 LB 培养基，37℃摇菌 30 min，6000rpm 离心 5min，弃上清，取 100 μl 菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将平板倒置，于 37℃过夜培养。
3.7 阳性克隆鉴定
我们推荐的方法是菌落 PCR。用无菌的枪头粘单个菌落挑至 20μl PCR 反应体系中。我们推荐您至少用一条通用测序引物进行菌落 PCR，这样可以避免 PCR假阳性的产生。将 PCR 阳性菌落的剩余菌液接种至含有适当抗生素的 LB 培养基中过夜培养，提取质粒做后续的鉴定。