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产品名称:

无缝克隆试剂盒

上市日期: 2017-05-11

1. 产品概要

重组克隆技术是目前一种最新型、快速、简洁的克隆技术,PCR产物连接载体不受酶切位点限制。将载体在选择克隆位点处进行线性化后,在插入片段 PCR 引物 5’端引入线性化克隆载体末端序列,使得插入片段 PCR 产物 5’和 3’ 最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15 bp~20 bp)。这种两端带有载体末端序列的 PCR 产物和线性化克隆载体按一定比例混合后,在Clone Mix 的催化作用下,仅需反应 50min 即可进行转化,完成定向克隆。克隆阳性率可达 95%以上。

产品优点 :

—简单、快速、高效

—稳定性强,室温可长期储存

—适用于几乎任何载体多克隆处任何位点进行定向克隆

—无需考虑插入片段自身携带的酶切位点

—可高效克隆 50 bp~10 kb 片段

—不依赖于连接酶及磷酸酶,克隆阳性率可达 95%以上

应用范围:

—适用于大片段

—快速克隆

—高通量克隆

—无缝克隆

—DNA 定点突变


2. 产品组成

组分

50T

100T

Clone Mix

200ul

400ul

 

3. 实验方案

3.1 实验流程

1)线性化载体制备

2)设计插入片段扩增引物

3)插入片段 PCR 扩增

4)重组反应

5)转化、涂板

6)阳性克隆鉴定

3.2 线性化载体制备

选择合适的克隆位点,并对克隆载体进行线性化。克隆载体线性化方式可以为限制性内切酶酶切消化,也可以为反向 PCR 扩增。

3.3 插入片段扩增引物设计

引物设计是很重要的,在设计引物时同样要遵循引物设计的基本原则,只不过上下游引物要加上 15~20bp 的载体同源序列。引物序列包括:5’-15~20bp 同源序列所需酶切位点序列(此处可不加)-特异性引物序列-3’。

3.4 插入片段 PCR 扩增

插入片段可用任意 PCR 酶(Taq 酶或高保真酶)扩增,无需考虑产物末端有无 A加尾(重组过程中将被去除,在最终载体中不会出现)。我们推荐您使用高保真聚合酶进行扩增,以减少扩增突变的引入。PCR 结束后,取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性。

Clone Mix 重组反应体系兼容常规 PCR 反应体系。因此,如扩增模板不是与克隆载体抗性相同的环状质粒,且 PCR 产物电泳条带单一,扩增产物无需纯化便可直接用于重组反应。若 PCR 扩增产物 DNA 纯度较低,直接使用进行重组反应时,重组效率、克隆阳性率都将会有所降低。因此,在进行较大片段(>5kb)克隆实验时,我们推荐您使用高质量的试剂盒对

扩增产物进行胶回收纯化以提高 DNA 纯度。

3.5 进行重组反应

于室温配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁,可通过短暂离心使其沉

入管底。

组分


Clone mix

4ul

插入片段

1-2ul

线性化载体

2ul

ddH2O

补足至10ul

无需冰上操作。混合后,55℃水浴 20min,再 30℃水浴 30min,转化或置于-20℃冰箱保存

3.6 反应产物转化、涂板

取 5 μl 反应液,加入到 50 μl 感受态细胞中,轻弹管壁数下混匀,在冰上放置30 min。42℃热激 90 s,冰水浴孵育 2 min。加入 900 μl SOC 或 LB 培养基,37℃摇菌 30 min,6000rpm 离心 5min,弃上清,取 100 μl 菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将平板倒置,于 37℃过夜培养。

3.7 阳性克隆鉴定

我们推荐的方法是菌落 PCR。用无菌的枪头粘单个菌落挑至 20μl PCR 反应体系中。我们推荐您至少用一条通用测序引物进行菌落 PCR,这样可以避免 PCR假阳性的产生。将 PCR 阳性菌落的剩余菌液接种至含有适当抗生素的 LB 培养基中过夜培养,提取质粒做后续的鉴定。


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