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植物超氧化物歧化酶的测定方法介绍(比色法)

日期: 2022-02-11
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超氧化物歧化酶(SOD)是生物体系中抗氧化酶系的重要组成成员,广泛分布在微生物、植物和动物体内。其是在上个世纪末才被发现,可以说是生物医学研究史上的一项重大成果,于人类生命研究具有极其重要的意义。今天我们就给大家分享一下如何通过比色法测定植物酶活SOD。


植物超氧化物歧化酶的测定方法介绍(比色法)

图片来源于网络

一、试剂

所有试剂除注明者外,均为分析纯。

1.1 磷酸缓冲液:

A液:0.2M的KH2PO4溶液 分析纯KH2PO4  27.216克,用蒸馏水定容至1000毫升。 

B液:0.2M的K2HPO4溶液 分析纯K2HPO4•3H2O 45.644克,用蒸馏水定容至1000毫升。

或 

A液:0.2M的NaH2PO4溶液 分析纯NaH2PO4•2H2O  31.21克,用蒸馏水定容至1000毫升。 

B液:0.2M的Na2HPO4溶液  分析纯Na2HPO4•12H2O 71.64克,用蒸馏水定容至1000毫升。

1.2 母液的配制: 

(1)0.5M 磷酸缓冲液(PH=7.8):A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml; 

(2)130mM Met(甲硫氨酸):取1.9399克Met 用磷酸缓冲液(PH=7.8)定容至100ml; 

(3)750μM四氮唑蓝(NBT):取0.06133gNBT用磷酸缓冲液(PH=7.8)定容至100ml(避光保存); 

(4)100μM EDTA-Na2:取0.0372g EDTA-Na2用磷酸缓冲液(PH=7.8)定容至1000ml; 

(5)20μM FD (核黄素):0.00753gFD用磷酸缓冲液(PH=7.8)定容至1000ml(现配现用)。 

1.3 SOD反应液: 

磷酸缓冲液(PH=7.8):Met:NBT:EDTA-Na2:核黄素(FD):H2O的比例为15:3:3:3:3:2.5,按母液顺序配制。 

二、主要仪器

万分之一分析天平、紫外分光光度计、医用离心机、研钵

三、试样的制备

取新鲜样本剪碎充分混匀后,装入样本瓶放入4℃冷藏备用。

四、分析步骤

4.1 酶液的制备: 

称取鲜样0.5g放入研钵中,加5毫升PH=7.8的磷酸缓冲液,冰浴研磨,匀浆倒入离心管中,冷冻离心20分钟(10000×g),上清液(酶液)倒入试管中,置于0~4℃下保存待用。 

4.2 SOD的测定 

取型号相同的试管,吸取20ul的酶液,加入3ml反应液,4000Lux照光(多用为环形日光灯的光照培养箱)30分钟(尽量做到照光情况一致)

4.3 空白与对照的制备

同时取四支试管,三支做对照(CK),一支做空白(不加酶液,以缓冲液代替);空白置暗处,对照(CK)与酶液同至于4000Lux条件下照光30分钟,遮光保存,以空白调零,560nm比色。 

4.4 若光照后颜色过深,可适当多取酶液进行测定

五、结果计算

SOD总活性(吸光度/g·FW)=(ACK—A)×V/(W×0.5×ACK)

式中:

ACK--为对照在560nm下测得的吸光度;

A--为试样在 560nm下测得的吸光度;

V--为提取液体积,ml;

W--为称取试样鲜重的质量,g;

0.5--为光照时间,h;

单位:NBT光还原50%为单位 

SOD比活性(酶单位/mg蛋白)= SOD总活性/可溶性蛋白质浓度


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