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关于赤霉素的测定

日期: 2021-09-02
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赤霉素的测定


赤霉素(Gibberellins,GAs)作为植物体内广泛存在的一类生长调节剂,是高等植物体内的一类四环二萜羧酸化合物,参与调控植物种子萌发,下胚轴伸长,叶片伸展,花、果实及种子发育等诸多生理过程。截至1976 年就从植物中分离鉴定出32种赤霉素,至今,发现的赤霉素的种类己有百种之多。

研究表明,赤霉素在植物抵抗非生物胁迫中也发挥着重要作用,主要通过调节GAs的生物合成、信号转导及其生物活性,以提高植物对非生物胁迫的耐受性。

一、实验方法及原理

本次实验通过提取样品中植物内源激素,再以安捷伦1290高效液相色谱仪串联AB公司Qtrap6500质谱仪,测定植物内源激素。

1.试剂

以下所有试剂如无特别注明,均为分析纯。实验用水为蒸馏水,去离子水或相当纯度的水。

赤霉素(GA3)标准品、CNW C18 QuEChers填料、色谱级甲醇、乙腈、乙腈(样品提取液)。

2.仪器设备

(1)TG-16G台式高速离心机、电子天平、Agilent 1290高效液相色谱仪、SCIEX-6500Qtrap(MSMS)、气浴恒温摇床、超声清洗仪、水浴氮吹仪。

3.标曲溶液配置

(1)取甲醇溶液990 μl加入1.5 ml离心管,加入500 μg/ml每种激素标准品储备液各2 μl,震荡均匀,配置为终浓度1 μg/ml的使用母液以备后续使用。

(2)取甲醇溶液999.9 μl、999.8 μl、999.5 μl、999 μl、998 μl、995 μl、980 μl分别加入1.5 ml离心管,而后取步骤(1)中配置的母液分别0.1 μl、0.2 μl、0.5 μl、1 μl、2 μl、5 μl、20 μl顺序加入上述甲醇溶液中,配置为终浓度0.1 ng/ml、0.2 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、20 ng/ml的标曲溶液。

4.流动相配置

(1)有机相:取色谱纯甲醇900 ml加入1 L容量瓶,加入1 ml甲酸,以甲醇定容至1 L,颠倒混匀。

(2)无机相:取超纯水900 ml加入1 L容量瓶,加入1 ml甲酸,以超纯定容至1 L,颠倒混匀。

5.植物激素提取

(1)准确称取样品约0.3-0.8 g,加入10倍体积乙腈溶液;

(2)4℃提取过夜,12000 g离心5 min,取上清液;

(3)沉淀再次加入5倍体积乙腈溶液,提取两次,合并所得上清液;

(4)加入15-40 mg C18填料,剧烈震荡30 s,10000 g离心5 min,取上清液;

(5)氮气吹干,以200 μl甲醇复溶,过0.22 μm有机相滤膜,放入-20℃冰箱待上机检测。

(6)进样体积:2 µl。

6 实验结果与分析

(1)植物样品中激素含量(ng/g)=检测浓度(ng/ml)×稀释体积(ml)/称取质量(g)

其中稀释体积为样品最终溶解进样时所用的溶液体积,称取质量为提取时的取样质量。

(2)检测浓度由待测物质峰面积代入标曲方程,由仪器自动求得。

表:GA3检测结果 

样品名称

稀释体积(ml)

称取质量(g)

检测浓度(ng/ml)

激素含量(ng/g)

1

0.200

0.734

0.32

0.087

2

0.200

0.833

0.26

0.062

3

0.200

0.319

0.29

0.18

4

0.200

0.684

0.25

0.073


GA3标准曲线

关于赤霉素的测定 

校准曲线

物质名称

校正曲线

相关系数R2

权重

线性范围(ng)

GA3

y = 7193.05815 x + 186.40775

0.99298

1/X2

0.1-20


讨论:赤霉素在植物组织中含量低种类多紫外检测信号弱使得同时定性定量测定多种赤霉素比较困难。利用荧光分光光度法阳和紫外分光光度法测定赤霉素灵敏度低且样本间误差比较大。利用LC-MS和GC-MS测定赤霍素准确性高,但仪器价格昂贵且测试费用较高。因此有相关研究开发准确且经济适用的赤霉素测试方法,例如凝胶渗透色谱(GPC)及HPLC定量测定植物组织中GAs的方法。




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