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土壤脲酶的检测

日期: 2021-09-02
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土壤脲酶的检测



靛酚蓝比色法



脲酶的作用是极为专一的,它仅能水解尿素,水解的最终产物是氨和碳酸。土壤脲酶活性,与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高,中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素情况。土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量,也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法是测定生成的氨量。

靛酚蓝比色法基本原理:被测物浸提剂中的NH4+,在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚反应,生成水溶性染料靛酚蓝,其深浅与溶液中的NH4+—N含量呈正相关。

1.试剂

所有试剂除注明者外,均为分析纯。实验用水均为蒸馏水或去离子水。

(1)10%尿素:称取10g尿素,用蒸馏水溶至100ml;

(2)柠檬酸盐缓冲液(PH6.7):184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并,用1mol/L NaOH将PH调至6.7,用水稀释至1000毫升; 

(3)苯酚钠溶液(1.35mol/L):62.5克苯酚溶于少量无水乙醇,加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮,用无水乙醇稀释至100毫升(A),存于冰箱中;27克NaOH溶于100毫升水(B)。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将AB溶液各20毫升混合,用蒸馏水稀释至100毫升; 

(4)次氯酸钠溶液:用水稀释试剂至活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定;

(5)氮的标准溶液(0.1mg/ml):精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml,得到1ml含有0.1mg氮的标准液。使用时将其稀释10倍,即为氮工作液(0.01mg/ml); 

(6)甲苯。

2.仪器设备

回旋式振荡器、万分之一分析天平、分光光度计、恒温箱、记号笔等。

3.标曲溶液配置

(1)标准曲线的测定:

分别吸取氮工作液0、1.00、3.00、5.00、7.00、9.00ml移至50ml比色管中,加水至20ml,再加入4ml苯酚钠的溶液,充分混合。紧接着加入3ml次氯酸钠,随加随摇匀,放置20分钟,用水稀释至刻度。将显色液在可见分光光度计上于578nm处,以1cm比色皿进行比色测定,以试剂空白为参比。以标准溶液氮含量为横坐标,以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

(2)土样中脲酶活性的测定:

分别称取适量过1mm筛的风干土样于50ml离心管中,向其中加入1ml甲苯,以使土样全部湿润为宜。放置15分钟后,加入10ml 10%尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液(pH6.7),并摇匀。将其放入37℃恒温箱中,培养24h。培养结束后,用热至38℃水稀释至刻度,充分摇荡后离心。分别吸取1-5ml滤液于50ml显色管中,加蒸馏水至20ml,充分震荡,然后加入4ml苯酚钠,充分混合,再加入3ml次氯酸钠充分摇荡,放置20分钟,用水稀释至刻度,溶液呈现靛酚的蓝色(在1h内保持稳定)。在分光光度计上用1cm比色杯,于578nm处进行比色测定。

土壤脲酶活性以24小时1g土壤中NH3—N的毫克数表示。

注:①无土对照:不加土样,其他操作与样品实验相同,以检验试剂纯度和基质自身分解,整个实验设1个。 

②无基质对照:以等体积水代替基质,其他与实验相同。即考察各种溶液和土壤中氨氮存在带来的影响。相当于其他实验中所做的空白对照。整个实验设1个。

③如果样品吸光值超过标曲的最大值,则应增加分取倍数或减少培养的土样。



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