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土壤微生物碳/氮/磷的检测方法

日期: 2021-08-20
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土壤微生物碳的测定--仪器分析法

1、仪器与试剂:

自动有机碳分析仪、真空干燥器、小烧杯(蒸发皿)、塑料瓶、中速定量滤纸、漏斗、震荡仪、电子称等

(1)无乙醇氯仿:氯仿中含有少量乙醇做稳定剂,乙醇会影响氯仿在低压下沸腾。所以需要提纯。

提纯:在通风橱中,将氯仿(三氯甲烷)按1:2的体积比与蒸馏水一起加入分液漏斗中,充分摇动1min,慢慢放出下层氯仿于烧杯中,如此重复洗涤三次。得到无乙醇氯仿,加入适量无水氯化钙,去除氯仿中的水分。可重复使用。

(2) 0.5mol/L硫酸钾溶液:称取硫酸钾87.1g,溶于去离子水中,稀释至1000ml

(3)  1mol/L NaoH溶液:称取氢氧化钠(AR)4g,置于一大烧杯中,并立即倒出,然后加入不含二氧化碳的蒸馏水约100mL,将溶液注入细口瓶中,塞紧橡皮塞,混匀,备用。 

2、操作步骤:

(1)培养

①称取过2mm筛的新鲜土样(相当于干土10g,取部分样测含水量,确定称取土样重量)2份,分别放入25ml小烧杯(培养皿)中。将盛有一份土样的烧杯放入真空干燥器中,并放置盛有无乙醇氯仿(约放置烧杯2/3的量)的25ml烧杯,烧杯内放入少量防爆沸玻璃珠,同时放入盛有1mol/L NaOH溶液的小烧杯(吸收熏蒸过程中释放出来的CO2)。

②盖上真空干燥器盖子,用真空泵抽真空,使氯仿保持沸腾5min。关闭真空干燥阀门,于25度黑暗条件下培养24h。另一份样置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

③熏蒸结束后,打开真空干燥器阀门(应该听到空气进入的声音,否则熏蒸不完全,重做,取出盛有氯仿(可重复利用)和稀NaOH溶液的小烧杯,清洁干燥器,反复抽真空(5到6次,每次30分钟,每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子),直到土壤无氯仿味道为止。

④从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样,将土样转移到80ml聚乙烯离心管(塑料瓶)中,加入40ml 0.5mol/L 硫酸钾溶液(土水比1:4)800 r/min振荡30分钟,用中速定量滤纸过滤。同时做一个无土壤机制空白。土壤提取液最好立刻分析,或--20℃冷冻保存,使用前需解冻摇匀。

仪器测定法:

吸取上述土壤提取液10ul注入自动总有机碳(TOC)分析仪上,测定提取液有机碳含量。(仪器使用方法待定)

3、结果计算: 

土壤微生物生物量碳:Bc=Ec/Kec

Ec为熏蒸与未熏蒸土壤的差值;

Kec为转换系数,取值为0.45

土壤微生物氮--氯仿熏蒸-TOC

1. 微生物氮测定

1.1、实验试剂

所有试剂除注明者外,均为分析纯。实验用水为蒸馏水或去离子水或相当浓度的水。

(1)无乙醇氯仿:氯仿中含有少量乙醇做稳定剂,乙醇会影响氯仿在低压下沸腾。所以需要提纯。

提纯:在通风橱中,将氯仿(三氯甲烷)按1:2的体积比与蒸馏水一起加入分液漏斗中,充分摇动1min,慢慢放出下层氯仿于烧杯中,如此重复洗涤三次。得到无乙醇氯仿,加入适量无水氯化钙,去除氯仿中的水分。可重复使用。

(2)硫酸钾提取剂;

(3)硫酸铬钾还原剂;

(4)硫酸铜溶液;

(5)10 mol L-1氢氧化钠溶液;

(6)4 mol L-1氢氧化钠溶液;

(7)0.01 mol L-1氢氧化钠溶液;

(8)硼酸溶液;

(9)标准硼砂溶液;

(10)指示剂贮存液;

(11)指示剂溶液;

(12)标准氯化铵贮存液;

(13)标准氯化铵溶液。

1.2、实验仪器

流动注射氮分析仪、真空抽滤瓶、容量瓶、其他仪器设备同土壤微生物碳。

1.3、实验步骤

(1)土壤前处理、熏蒸、提取同微生物碳处理。

(2)提取液中硝态氮还原:吸取15.0 ml熏蒸与不熏蒸土壤0.5 mol L-1 K2SO4浸提液于250 ml消化管中,加入10 ml硫酸铬钾还原剂和300 mg锌粉,至少放置2 h后再消化。研究结果表明熏蒸与不熏蒸土壤提取液中硝态氮含量差异很小,在测定土壤MB-N时,可以不包括硝态氮,即省略提取液中硝态氮还原过程。

(3)消化:方法Ⅰ:吸取10.0 ml熏蒸与不熏蒸土壤0.5 mol L-1  K2SO4浸提液(或经还原反应后的浸提液)于250 ml消化管中,加入0.2 ml 0.19 mol L-1 CuSO4溶液、5 ml分析纯浓硫酸、及少量防瀑沸的颗粒物(如经浓硫酸处理并洗涤后烘干的瓷片,0.5 cm大小),混合液消化变清后再回流3 h。

(4)消化液中氮测定:消化液冷却后,用去离子水洗涤转移到100 ml容量瓶中,至体积大约为70 ml,待再冷却后慢慢加入10 ml 10 mol L-1NaOH溶液中和部分H2SO4,边加边充分混匀(以免因局部碱浓度过高而引起消化液中NH4+的损失),再用去离子水定容至100 ml。溶液中NH4+含量采用流动注射氮分析仪(FIAStar 5000型)测定。采用40 µl样品圈,KTN扩散膜(耐强酸和强碱),载液为去离子水,试剂Ⅰ为4 mol L-1 NaOH溶液,试剂Ⅱ为指示剂溶液。

(5)校正曲线溶液制备:分别取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml 50 µg N ml-1标准氯化铵溶液于100 ml容量瓶中,分别用去离子水洗涤转移1个空白消化液于容量瓶中,其余操作步骤同样品,用去离子水定容至100 ml,即得浓度分别为0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 µg N ml-1系列标准氯化铵溶液,采用测定KTN方法模块测定和制备工作曲线,校正曲线溶液最少应每个月制备一次。其他具体操作参见仪器使用说明。

1.4、计算:

土壤MB-N = EN/KEN

式中:EN = 熏蒸土壤提取的全氮 – 不熏蒸土壤提取的全氮;

kEN为转换系数,取值0.25。

土壤微生物磷的测定--无机磷测定法

1、仪器与试剂:分光光度计,培养皿、真空干燥器、25ml、1000ml容量瓶、塑料瓶。

(1)无乙醇氯仿

(2)0.5mol/L NaHCO3 浸提液:溶解 NaHCO3 42.0g于800mL水中,以0.5mol/L NaOH溶液调节浸提液的PH至8.5,再用去离子水稀释至1000mL。(此溶液爆于空气中可因失去CO2而使PH增高,应现配现用)

(3)250mg/L磷酸二氢钾溶液:称取1.0984g分析纯磷酸二氢钾(称量前105℃烘2-3小时),溶于去离子水并定容至1000mL .

(4)钼锑抗试剂:

5g /L酒石酸氧锑钾溶液:称取钼酸铵0.5g,溶于100mL水中

‚钼酸铵-硫酸溶液:称取钼酸铵10g,溶于450mL水中,缓慢地加入153mL浓H2SO4,边加边搅拌。

再将上述溶液加入到‚溶液中,最后加水至1000mL 。充分摇匀,储存于棕色瓶中,此为钼锑抗混合液。

临用前(当天),称取左旋抗坏血酸1.5g,溶于100mL 钼锑抗混合液中,混匀,此即钼锑抗试剂。有效期24h。

(5)磷标准溶液:准确称取在105℃烘箱中的KH2PO4(分析纯)0.2195g,溶解在400mL水中,加浓H2SO4 5mL(加H2SO4防长霉菌,可使溶液长期保存),转入1000mL容量瓶中,加水至刻度。此溶液为50ug/mL磷标准溶液。吸取上述磷标准溶液25mL,用去离子稀释定容至250mL,即得5ug/mL磷标准溶液(此溶液不宜久存)。

(6)0.5mol/L NaOH溶液:称取氢氧化钠(AR)2g,置于一大烧杯中,并立即倒出,然后加入不含二氧化碳的蒸馏水约100mL,将溶液注入细口瓶中,塞紧橡皮塞,混匀,备用。

2、操作步骤:

(1)称取过称取过2mm筛的新鲜土样(相当于干土5g)3份,分别放入3个25ml小烧杯中。一份熏蒸,两份不熏蒸。熏蒸处理同测定微生物碳。

(2)从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸一份土样,将土样转移到250毫升聚乙烯提取瓶(塑料瓶)中,加入100ml 0.5mol/L NaHCO3 浸提液(水土比20:1),300r/min振荡30min ,用慢速定量滤纸过滤。同时做一个无土壤机制空白。土壤提取液最好立刻分析,或-20℃冷冻保存,使用前需解冻摇匀。

(3)另一份未熏蒸土样放入250毫升聚乙烯提取瓶(塑料瓶),加入0.5ml 250mg/L磷酸二氢钾溶液,再加入100mL 0.5mol/L NaHCO3 浸提液,同上进行提取。(用来测定外加正磷酸盐态无机磷的回收率Rpi,以校正土壤对熏蒸处理所释放出来的微生物生物量磷的吸附与固定。)

(4)吸取上述3种提取液10ml(依样品含磷量而定)于25ml容量瓶中,吸取外加磷的提取液5ml。加入适量的1.0mol/L HCL溶液进行中和,HCL溶液的加入量通常为提取液体积的一半。(即加入5ml,外加磷的提取液加入2.5ml),放置4小时并间隙振荡(以排除溶液中的CO2)补充去离子水至20mL(看情况添加),加入4mL混合显色剂,再加水定容,摇匀。显色完全(约30min)后,在880nm波长处进行比色。

3、标准曲线:准确吸取5ug/mL,磷标准溶液0、0.5、1、2、3、4、5mL分别放入25ml容量瓶中,加水约至20ml,然后加钼锑抗试剂4ml,最后用水定容至25mL。30min后开始进行比色。

4、结果计算:土壤微生物生物量磷(Bp):Bp=Epi/(Kp*Rpi)

式中:

Epi为熏蒸和未熏蒸土壤的差值;

Rpi为(外加磷酸二氢钾溶液土壤的测定值-未熏蒸土壤的测定值)/25*100%;

Kp为转换系数,取值为0.4。


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案例名称: 孵化中心流程
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