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17种水解氨基酸的测定:高效液相色谱法

日期: 2022-03-17
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今天,我们通过5个食品样本的分析案例给大家分享一下如何通过高效液相色谱法对17种水解氨基酸进行测定:

一、实验方法及原理

试样经酸水解得各种氨基酸后,经高效液相色谱在线衍生检测分析外法定量测定氨基酸酸的含量。

二、实验步骤

2.1主要实验仪器     

HPLC(紫外检测器,在线衍生)

离心机(12000rpm)

天平(0.01g,0.1mg)

超声波清洗机(240w)

干式氮吹仪(100℃)

烘箱(105℃,115℃)

2.2 实验步骤

1、 水解:

准确称取一定量试样(精确至0.0001g),使试样中蛋白质含量在10mg~20mg范围内。将称量好的样品置于水解管中。根据试样的蛋白质含量,在水解管内加10mL~15mL6M盐酸溶液。用氮气置换管内空气后密封。

2、 水解管在115±5℃烘箱中水解22~24h后放至室温,取出水解液,用0.22μm孔径的滤膜过滤,取1ml续滤液至进样小瓶中,100℃氮吹干后用0.1M的HCL水溶液超声溶解固体物质,取溶液直接进样。(根据实际浓度可以用0.1M的HCL水溶液适当稀释,一般植物均可用1mL 0.1M HCL水溶液稀释)

3、 标准溶液配制:

购买市售标准溶液(10pmol/μL、25pmol/μL、100pmol/μL、250pmol/μL、1000pmol/μL)。

2.3 色谱条件

参数

色谱柱

AdvanceBio AAA C18,4.6 × 100 mm, 2.7 µm

流速

1.5 mL/min

柱温

40 °C

流动相

A) 10 mmol/L 磷酸氢二钠和 10 mM硼酸钠溶液,用盐酸将 pH 调节为 8.2

B) 甲醇:乙腈:水,45:45:10 (v:v:v)

梯度程序

时间 (min) %B

0.0 2

0.35 2

15.7 100

15.8 2

18.0 2

检测器

338 nm,带宽 10 nm;参比 390 nm,带宽 20 nm(一级氨基酸)

262 nm,带宽 16 nm;参比 324 nm,带宽 8 nm(二级氨基酸)

进样程序

• 吸取 2.5 μL 硼酸盐缓冲液(1号瓶)

• 吸取 1.0 μL 样品

• 在清洗口3.5 μL 混合液混合 5 次

• 等待 0.2 分钟,然后吸取 0.5 μL OPA(2号瓶)

• 在清洗口将 4 μL 混合液混合 10 次

• 吸取 0.4 μL FMOC(3号瓶)

• 在清洗口将 4.4 μL 混合液混合 10 次

• 吸取 32 μL 稀释剂(4号瓶,此步骤一般情况不使用)

• 在清洗口将 20 μL 混合液混合 8 次

• 进样

• 等待 0.1 分钟

• 阀切换至旁路

2.4 测定方法

依据保留时间一致性进行定性识别,曲线外标法定量。根据标准样品的保留进间确定样品中目标物的色谱峰。以标准样品目标物的峰面积为纵坐标、浓度(单位:mg/L)为横坐标拟定曲线。再根据样品中目标物峰面积计算得出样品中目标物的浓度,从而计算样品中目标物的含量。

2.5 计算方法

17种水解氨基酸的测定:高效液相色谱法




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