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土壤中过氧化氢酶、过氧化物酶、硝酸盐还原酶的检测方法

日期: 2021-08-20
标签:
过氧化氢酶--滴定法


01
实验试剂

1.0.3%的过氧化氢溶液:将30%过氧化氢稀释100倍。 

2.3N硫酸:吸取10mL盐酸用蒸馏水稀释至50ml。

3.0.1N高锰酸钾溶液:1.58g高锰酸溶于100ml水。  

02
主要仪器

万分之一分析天平、震荡器、滴定管、试管夹

03
试样的制备

取新鲜的实验室待测样品充分混匀后,按四分法缩减至100g,粉碎,然后全部通过10目孔径筛,装入样品袋备用。

04
实验方法

1.称取2g试样于50ml离心管中,加40ml蒸馏水,5ml0.3%过氧化氢溶液于震荡机震荡20min,取出后加入5ml3N硫酸,过滤后取25ml滤液与150ml三角瓶中,用0.1N高锰酸钾滴定至淡粉红色。

2.空白:不加土样, 其他操作与样品试验相同。

05
计算方法

 过氧化氢酶活性= (V-VS)C×51/V0×17/W

 V:为滴定空白所用的KMnO4体积;

 VS:为滴定样品所用的KMnO4体积;

 C: 为KMnO4浓度;

 V0:为滴定体积25ml;

 W:为土重;


土壤中过氧化氢酶、过氧化物酶、硝酸盐还原酶的检测方法
过氧化物酶--比色法

01
试剂配制

     1.1%邻苯三酚溶液:称取1g邻苯三酚,用蒸馏水融至100ml。
     2.0.5%H2O2溶液:取1ml30%H2O2稀释至60ml。
     3.乙醚
     4.0.5mol/L HCL:吸4.17mL的浓盐酸溶于100mL水
     5.PH4.5柠檬酸磷酸缓冲溶液:0.1mol/L柠檬酸溶液: 19.2g C6H7O8溶至1L。0.2mol/L磷酸氢二钠溶:53.63gNa2HPO4.7H2O或者71.7g Na2HPO4.12H20溶至1L。取10.65ml柠檬酸和9.35mINa2HPO4混匀(用量较多可以乘以倍数配制),之后再用这两种溶液调节PH即可。
     6.重铬酸钾标准溶液:0.75g重铬酸钾溶于1L0.5mol/LHCL溶液中。此时的溶液相当于50ml醚中含有5mg紫色没食子素。
02
主要仪器

    万分之一分析天平、恒温摇床、分光光度计

03
试样的制备

     取新鲜的实验室待测样品充分混匀后,按四分法缩减至100g,粉碎,然后全部通过10目孔径筛,装入样品袋备用。

04
分析步骤

     1.试样溶液提取

称取试样1g,精准至0.001g,置于50ml离心管中,然后注入10m1%邻苯三酚溶液和2ml0.5%H2O2溶液。震荡后放置30°C恒温培养箱中培养2小时。取出待测。

     2.空白溶液制备

除不加待测样品外,应用的试剂和步骤操作同4.1。

     3.对照试样溶液制备

除用10 mL蒸馏水代替基质(邻苯三酚溶液)外,应用的试剂和步骤操作同4.1。

     4.标准曲线绘制

取重铬酸钾标准溶液0、1、2、4、6、8ml于比色管中用0.5mol的HCL稀释至50ml。定容后,在分光光度计。上于430nm处比色测定。以吸光度为横坐标,以浓度为纵坐标绘制标准曲线。 

     5.试样测定

试样滤液加4mlPH4.5的柠檬酸-磷酸缓冲溶液,再加35ml乙醚, 用力震荡数次,萃取30min。最后,将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相比色。比色波长为430nm。为了防止因乙醚引起的误差,每比色一次用无水乙醇洗涤比色槽一次。 

05
结果计算
  
     过氧化氢酶活性,以2h后,1g土壤生成的紫色没食子素毫克数表示。

过氧化物酶活性= (a样品-a空白-a无基质) ×V/m

a为标曲上相对应的浓度。

V为显色体积,即为乙醚的体积35ml。

m为样品重量g。


土壤中过氧化氢酶、过氧化物酶、硝酸盐还原酶的检测方法
硝酸盐还原酶--比色法

01
实验试剂

1.1% KNO溶液;

2.1%葡萄糖;

3.CaCO3 

4.铝钾钒饱和液;

5.酚二磺酸:取3g重蒸酚与37g21.0ml)浓硫酸混合,在沸水浴上回流加热6h

6.10% NaOH

7.KNO3 标准液:精确称取16.3052g重结晶KNO3 溶于蒸馏水中并稀释至1L。使用前,将标准液再进行稀释100倍(1ml0.1mgNO3---N)。

02
主要仪器
  

万分之一分析天平,恒温箱,水浴锅,分光光度计

03
试样的制备

取新鲜的实验室待测样品充分混匀后,按四分法缩减至 100g,粉碎,然后全部通过10目孔径筛,装入样品袋备用。 

04
实验过程
  
     1.试样溶液提取,测定

1g土壤置于100ml减压三角瓶中,加20mgCaCO3 1ml 1% KNO。仔细混合后,加1ml葡萄糖作为氢的供体,抽气3min,稍摇荡三角瓶,置于30℃恒温培养24h

培养结束后,加50ml水,1ml铝钾钒液。取20ml液移于磁皿上蒸干。加1 ml酚二磺酸处理10min。再加15ml蒸馏水,用10% NaOH调至微黄色,定容后于分光光度计上于400500处进行比色。

     2.对照试样溶液制备

用灭菌土壤(180℃3h)代替试样作对照,其余步骤同4.1

     3.空白溶液制备

除不加待测样品外,应用的试剂和步骤操作同4.1。

     4.标准曲线绘制

吸取50ml KNO3 标准溶液,置于磁皿中,在沸水浴上蒸干,残渣用2ml酚二磺酸处理10min。再加15ml蒸馏水,定容至500ml(1ml含0.01mgNO3---N))。吸取此溶液5-40ml于50ml容量瓶中,用10% NaOH调至微黄色,定容后于分光光度计上于400—500处进行比色,以光密度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。



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    2024 - 09 - 20
    一、试剂药品浓盐酸,氢氧化钠,氯化钡,酚酞二、试剂配制2.1.0.05mol/l盐酸:取4.16ml浓盐酸缓缓加入1000mlUP 水中。2.2.0.1mol/l氢氧化钠:0.4g氢氧化钠用UP水定容至100ml。2.3.酚酞指示剂:称取0.5g酚酞,用95%乙醇溶解定容至100ml。2.4.11mol/l氯化钡溶液:20.82g氯化钡用UP水定容至100ml。三、洗涤方法所有新的玻璃器皿:用洗涤剂清洗干净后,再用自来水洗,再超声,再用UP水冲洗,再放入90度烘箱烘干。四、实验方法4.1 土壤预培养:称取适量土壤样品置于常温下预培养数天,使土壤恢复到常温状态。4.2 密闭培养:将恢复到常温状态的样本,称取10g置于250ml广口具塞瓶中,内置盛有10ml0.1mol/l氢氧化钠溶液的小玻璃瓶,用蒸馏水调节土壤湿度至其最大持水量的60%,5℃恒温培养7天。4.3 测定:培养结束后取出里面盛氢氧化钠的小玻璃瓶,先加入2ml氯化钡溶液,再加入2滴酚酞指示剂,再用0.05mol/l的盐酸滴定至红色消失,记录滴定体积,计算出CO2的释放量,同时做空白对照(空白用水代替)。更多检测相关讯息so栢晖生物了解~
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    2024 - 09 - 12
    1、试剂柠檬酸(AR) 柠檬酸三钠(AR) 无水甲醇(AR) 三氯甲烷(AR) 丙酮(AR) 甲苯(AR) 氢氧化钾(AR) 冰乙酸(AR) 正己烷(色谱纯) 十九烷酸甲酯(19:0)2、仪器气相色谱仪 冻干机 振荡仪 过柱装置 水浴锅 水浴氮吹仪 干式氮吹仪 高速离心机3、材料高速离心管 试管(100 mL、5 mL) 10 mL具塞试管 3 mL硅胶柱 玻璃滴管(可拆卸橡胶头)黑色塑料袋 玻璃量筒(1 mL、5 mL) 移液器(5 mL、1 mL、100 μL)4、试剂制备柠檬酸缓冲液:称取柠檬酸37.5 g,柠檬酸三钠44.1 g,溶于1 L超纯水中。提取液:依次加入柠檬酸缓冲液64 mL、无水甲醇160 mL、三氯甲烷80 mL,混合均匀。(现用现配,低温隔夜会析出盐)。甲醇甲苯混合溶液(1:1):15 mL无水甲醇、15 mL甲苯混合均匀(现用现配)。0.5 mol/L KOH溶液:称取28.05 g KOH,溶于1 L超纯水中。0.2 mol/L KOH甲醇溶液(2:3):取0.5 mol/L KOH溶液40 mL,溶入60 mL无水甲醇。1 mol/L冰乙酸溶液:取1.74 mL冰乙酸,溶入30 mL去离子水。5、样品处理土样冻干:称取土壤4.00 g(沙土8.00g)于高速离心管中,冰冻过夜,随后放入冻干机冻干。土壤含水率测定:称取土壤5.00 g于105 ℃下烘干3 h,随后冷却至室温,取出称重,计算含水率。6、测定6.1取出冻干土样,加入23ml提取液,避光振荡2h;6.2离心取上清液,重复步骤1 ,合并两个上清液;6.3依次加入三氯甲烷、柠檬酸缓冲液,避光过夜;6.4去除上清液,吹干三氯甲烷;6.5过柱;6.6吹干无水甲醇,用甲醇甲苯溶液、KOH甲醇溶液复溶,水浴,冷却至室温;6.7加入去离子水、冰乙酸...
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    一、微生物碳利用效率的概念及其环境意义微生物碳利用效率(CUE):微生物分配给生长的碳量占吸收总碳量的比率,体现了微生物合成代谢和分解代谢之间的平衡。二、微生物碳利用效率测定的原理设置18O标记处理以及加入等量自然丰度水的对照组,通过培养过后DNA中18O丰度的差值来判读加入土壤的标记水有多少进入了新产生的DNA中,由此估算微生物生长速率。测定方法——18O-H2O培养法:试样的准备:收集200g左右田间土壤样品,混匀,将其中的大约100g土壤鲜样通过2mm 孔径筛,去除石头和肉眼可见的根等杂质,装入聚乙烯样品袋备用。预培养:*土壤野外采回后迅速过2mm筛,去除土壤内石块、根系、凋落物等;*烘干法测量土壤含水量土壤;*尽快将过筛后土壤熏蒸浸提法测量微生物MBC;(1) 田间持水率的测定调整土壤含水量到60%田间持水量(WHC,water holding capacity);将土壤放入实验所需温度培养箱进行预培养,预培养时间遵照实验设计(2)预培养土样控水处理18O标记培养一个样本一个对照组,或根据样本情况挑选20%样品做对照土壤DNA的提取野外采集土壤带回实验室迅速分装冻干提取DNA,并测得DNA含量。18O丰度测定吸取DNA提取液于洁净的银囊(已称重)中并置于60℃烘箱中干燥整夜后(称重)包好,用质谱仪测定18O丰度和总氧含量。MBC测定氯仿熏蒸提取法...计算更多检测相关讯息so栢晖生物了解更多~
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案例名称: 孵化中心
说明: 栢晖生物科技有限公司项目孵化中心成立于2015.06.01日,研发领域涉及生物试剂耗材、仪器、新产品开发及各生物科技服务类项目等。自成立以来,陆续吸引了大批专家教授加盟合作,并与全国数十家高校及知名企业建立了良好的合作关系。中心共有博士及以上学位骨干人员10人,专门负责公司新产品研发等工作,已成功研发出无线温度监控器及NO检测试剂盒等产品(详情见成功案例),另有细胞分选仪等三个项目正在积极孵化当中。
2017 - 05 - 31
案例名称: 孵化中心流程
说明:
2017 - 07 - 17
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