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土壤中过氧化氢酶、过氧化物酶、硝酸盐还原酶的检测方法

日期: 2021-08-20
标签:
过氧化氢酶--滴定法


01
实验试剂

1.0.3%的过氧化氢溶液:将30%过氧化氢稀释100倍。 

2.3N硫酸:吸取10mL盐酸用蒸馏水稀释至50ml。

3.0.1N高锰酸钾溶液:1.58g高锰酸溶于100ml水。  

02
主要仪器

万分之一分析天平、震荡器、滴定管、试管夹

03
试样的制备

取新鲜的实验室待测样品充分混匀后,按四分法缩减至100g,粉碎,然后全部通过10目孔径筛,装入样品袋备用。

04
实验方法

1.称取2g试样于50ml离心管中,加40ml蒸馏水,5ml0.3%过氧化氢溶液于震荡机震荡20min,取出后加入5ml3N硫酸,过滤后取25ml滤液与150ml三角瓶中,用0.1N高锰酸钾滴定至淡粉红色。

2.空白:不加土样, 其他操作与样品试验相同。

05
计算方法

 过氧化氢酶活性= (V-VS)C×51/V0×17/W

 V:为滴定空白所用的KMnO4体积;

 VS:为滴定样品所用的KMnO4体积;

 C: 为KMnO4浓度;

 V0:为滴定体积25ml;

 W:为土重;


土壤中过氧化氢酶、过氧化物酶、硝酸盐还原酶的检测方法
过氧化物酶--比色法

01
试剂配制

     1.1%邻苯三酚溶液:称取1g邻苯三酚,用蒸馏水融至100ml。
     2.0.5%H2O2溶液:取1ml30%H2O2稀释至60ml。
     3.乙醚
     4.0.5mol/L HCL:吸4.17mL的浓盐酸溶于100mL水
     5.PH4.5柠檬酸磷酸缓冲溶液:0.1mol/L柠檬酸溶液: 19.2g C6H7O8溶至1L。0.2mol/L磷酸氢二钠溶:53.63gNa2HPO4.7H2O或者71.7g Na2HPO4.12H20溶至1L。取10.65ml柠檬酸和9.35mINa2HPO4混匀(用量较多可以乘以倍数配制),之后再用这两种溶液调节PH即可。
     6.重铬酸钾标准溶液:0.75g重铬酸钾溶于1L0.5mol/LHCL溶液中。此时的溶液相当于50ml醚中含有5mg紫色没食子素。
02
主要仪器

    万分之一分析天平、恒温摇床、分光光度计

03
试样的制备

     取新鲜的实验室待测样品充分混匀后,按四分法缩减至100g,粉碎,然后全部通过10目孔径筛,装入样品袋备用。

04
分析步骤

     1.试样溶液提取

称取试样1g,精准至0.001g,置于50ml离心管中,然后注入10m1%邻苯三酚溶液和2ml0.5%H2O2溶液。震荡后放置30°C恒温培养箱中培养2小时。取出待测。

     2.空白溶液制备

除不加待测样品外,应用的试剂和步骤操作同4.1。

     3.对照试样溶液制备

除用10 mL蒸馏水代替基质(邻苯三酚溶液)外,应用的试剂和步骤操作同4.1。

     4.标准曲线绘制

取重铬酸钾标准溶液0、1、2、4、6、8ml于比色管中用0.5mol的HCL稀释至50ml。定容后,在分光光度计。上于430nm处比色测定。以吸光度为横坐标,以浓度为纵坐标绘制标准曲线。 

     5.试样测定

试样滤液加4mlPH4.5的柠檬酸-磷酸缓冲溶液,再加35ml乙醚, 用力震荡数次,萃取30min。最后,将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相比色。比色波长为430nm。为了防止因乙醚引起的误差,每比色一次用无水乙醇洗涤比色槽一次。 

05
结果计算
  
     过氧化氢酶活性,以2h后,1g土壤生成的紫色没食子素毫克数表示。

过氧化物酶活性= (a样品-a空白-a无基质) ×V/m

a为标曲上相对应的浓度。

V为显色体积,即为乙醚的体积35ml。

m为样品重量g。


土壤中过氧化氢酶、过氧化物酶、硝酸盐还原酶的检测方法
硝酸盐还原酶--比色法

01
实验试剂

1.1% KNO溶液;

2.1%葡萄糖;

3.CaCO3 

4.铝钾钒饱和液;

5.酚二磺酸:取3g重蒸酚与37g21.0ml)浓硫酸混合,在沸水浴上回流加热6h

6.10% NaOH

7.KNO3 标准液:精确称取16.3052g重结晶KNO3 溶于蒸馏水中并稀释至1L。使用前,将标准液再进行稀释100倍(1ml0.1mgNO3---N)。

02
主要仪器
  

万分之一分析天平,恒温箱,水浴锅,分光光度计

03
试样的制备

取新鲜的实验室待测样品充分混匀后,按四分法缩减至 100g,粉碎,然后全部通过10目孔径筛,装入样品袋备用。 

04
实验过程
  
     1.试样溶液提取,测定

1g土壤置于100ml减压三角瓶中,加20mgCaCO3 1ml 1% KNO。仔细混合后,加1ml葡萄糖作为氢的供体,抽气3min,稍摇荡三角瓶,置于30℃恒温培养24h

培养结束后,加50ml水,1ml铝钾钒液。取20ml液移于磁皿上蒸干。加1 ml酚二磺酸处理10min。再加15ml蒸馏水,用10% NaOH调至微黄色,定容后于分光光度计上于400500处进行比色。

     2.对照试样溶液制备

用灭菌土壤(180℃3h)代替试样作对照,其余步骤同4.1

     3.空白溶液制备

除不加待测样品外,应用的试剂和步骤操作同4.1。

     4.标准曲线绘制

吸取50ml KNO3 标准溶液,置于磁皿中,在沸水浴上蒸干,残渣用2ml酚二磺酸处理10min。再加15ml蒸馏水,定容至500ml(1ml含0.01mgNO3---N))。吸取此溶液5-40ml于50ml容量瓶中,用10% NaOH调至微黄色,定容后于分光光度计上于400—500处进行比色,以光密度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。



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案例名称: 孵化中心流程
说明:
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